Quantificazione del NAD+ e dei suoi metaboliti nei nervi sciatici di topo
Introduzione
Le parti cruciali della nicotinammide adenina dinucleotide (NAD+) e dei suoi metaboliti nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione sono state ampiamente riconosciute. Per stimolare il progresso verso la ricerca biochimica e gli interventi mirati all'invecchiamento e alle malattie neurodegenerative, è di grande importanza quantificare con precisione i livelli di NAD+ e dei suoi metaboliti nella via di salvataggio del NAD+. In questo caso, viene applicato un metodo LC-MS/MS robusto e accurato per quantificare i livelli di NAD+ e dei suoi metaboliti nel nervo sciatico di topo normale e danneggiato.
Limitazioni dei metodi esistenti per quantificare il NAD+ e i suoi metaboliti
I metodi tradizionali per quantificare il NAD+ e i suoi metaboliti, come l'HPLC-UV, NMR, l'elettroforesi della zona capillare o i saggi enzimatici colorimetrici, devono affrontare varie sfide in termini di sensibilità, selettività e misurazione indiretta. Per quanto riguarda i test LC-MS/MS esistenti per le misure cellulari o tissutali di NAD+ e dei suoi metaboliti, ci sono ancora molte difficoltà da superare, come tempi di esecuzione prolungati, scarso comportamento di ritenzione cromatografica e forme dei picchi insoddisfacenti. Inoltre, solo da una a tre sostanze nella via di recupero del NAD+ possono essere coperte da questi metodi.
Le modifiche del metodo LC-MS/MS
Sulla base dei test LC-MS/MS esistenti, vengono effettuate le modifiche relative alle condizioni cromatografiche, alla matrice surrogata e alle condizioni MS/MS. In particolare, 5 μM di acido metilene fosfonico sono impiegati come additivo per la fase mobile, che promuove esplicitamente l'intensità del segnale e la forma del picco. Data la natura relativamente pulita e semplice dei campioni mai e le loro piccole dimensioni, l'acqua ultrapura viene testata come matrice sostitutiva. Al posto della colonna per cromatografia liquida con interazione idrofila e della colonna per ipercarboidrati, viene utilizzata la colonna Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, la cui esclusiva tecnologia di superficie ad alte prestazioni MaxPeak HPS (passivazione della parete interna della colonna, eliminazione della superficie metallica) consente l'elevata riproducibilità, la simmetria dei picchi e la separazione della linea di base di tutti gli analiti.Inoltre, le condizioni MS sono ottimizzate per ridurre al minimo il segnale di interferenza NAD+ nel canale ciclico dell'adenosina difosfato ribosio (cADPR) mantenendo la risposta del cADPR e del mononucleotide di nicotinammide (NMN), con 4000 V per la tensione di spruzzatura ionica, 450 °C per la temperatura del turboriscaldatore, 50 psi per il gas 1, 50 psi per il gas 2, 30 psi per il gas a cortina e 12 psi per il gas di collisione.
Cromatogramma rappresentativo di campioni nervosi (normali vs danneggiati)
Tutti e cinque gli analiti raggiungono la separazione basale, dove cADPR è un biomarcatore sensibile nel modello di neurodegenerazione. In questo caso, l'assotomia del nervo sciatico induce la degenerazione assonale, portando a una riduzione del livello di NAD+ e a un aumento del livello di NMN nei nervi danneggiati, con conseguente aumento di circa 2 volte del rapporto NMN/NAD+. Contemporaneamente, i livelli di nicotinamide (NAM) e adenosina difosfato ribosio (ADPR) sono diminuiti di circa 2 volte, mentre il livello di cADPR è aumentato di oltre 8 volte. Questi risultati sono coerenti con quelli della ricerca precedentemente riportata, che verifica l'accuratezza di questo metodo LS-MS/MS modificato nella quantificazione del NAD+ e dei suoi metaboliti.
Conclusione
Questo metodo LC-MS/MS modificato consente un'efficace separazione basale di NAD+, NMN, NAM, ADPR e cADPR in un breve periodo di 5 minuti, contribuendo alla diagnosi precoce di vari disturbi neurologici e allo sviluppo di farmaci per l'invecchiamento e le malattie neurodegenerative.
Riferimento
Sviluppo e convalida di un metodo LC-MS/MS per quantificare il NAD+ e i metaboliti correlati nei nervi sciatici dei topi e la sua applicazione a un modello animale con lesione nervosa. J Cromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821
BONTAC NAD
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