Ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita attraverso la manipolazione della rigenerazione dei cofattori redox

Una gamma sempre più ampia di sostanze chimiche viene ora prodotta da materie prime rinnovabili attraverso mezzi biotecnologici. I bioprocessi si basano fortemente sulla catalisi enzimatica per la produzione efficiente di questi composti. Garantire che gli enzimi funzionino in modo ottimale nell'ambiente richiesto è quindi di grande interesse per una produzione sostenibile.

Proprietà come la specificità del substrato, la velocità catalitica e la (termo)stabilità sono tra i diversi fattori critici che devono essere ottimizzati per bioprocessi efficienti guidati da enzimi. Questa ottimizzazione può richiedere molto tempo, essere costosa e impegnativa, e quindi modi efficaci ed economici probabilmente per la selezione accoppiata alla crescita, gli enzimi ingegneristici con caratteristiche desiderabili sono molto ricercati.

I vantaggi dell'utilizzo della selezione accoppiata alla crescita come forma di selezione enzimatica, che comporta il collegamento dell'attività di un enzima alla crescita di una cellula. Questo metodo può essere utilizzato come strategia di selezione ad alto rendimento e può essere ottenuto assicurando che la crescita dipenda dalla sintesi del prodotto da parte dell'enzima bersaglio o collegando l'attività dell'enzima allo stato energetico globale della cellula. La biologia sintetica può essere utilizzata per progettare ceppi adatti alla selezione accoppiata alla crescita, e recenti progressi si sono concentrati su ceppi ingegneristici carenti negli stati ossidati o ridotti delle coppie di cofattori redox, che possono servire come piattaforme di ingegneria enzimatica. L'uso di queste piattaforme può accelerare lo sviluppo di biocatalizzatori e bioprocessi migliorati.

Vantaggi dell'accoppiamento della crescita tramite auxotrofia dei cofattori

I vantaggi dell'utilizzo dell'auxotrofia dei cofattori come metodo di selezione per gli enzimi ingegneristici coinvolti nella biosintesi di alcune sostanze chimiche, come lipidi, biocarburanti, gas, solventi organici o composti polimerici. Questo approccio offre diversi vantaggi unici, tra cui la possibilità di selezionare il prodotto desiderato indipendentemente dal substrato o dal prodotto di interesse, rendendo più facile rilevare una migliore attività enzimatica e offrendo una lettura per rilevare una migliore attività enzimatica. Inoltre, l'uso di auxotrofi di cofattori come piattaforme di accoppiamento della crescita è vantaggioso perché la natura ubiquitaria dei cofattori redox nel metabolismo microbico significa che le strategie ingegneristiche possono essere trasferibili lateralmente ad altri microbi di interesse e gli enzimi possono essere ingegnerizzati direttamente all'interno dell'ambiente dell'ospite microbico desiderato. (mostrato come figura 1)

Figura 1: Confronto di diverse tecniche di screening/selezione ampiamente utilizzate per l'ingegneria enzimatica

Mutanti carenti di ossidazione del NADH

L'ossidazione del NADH in E. coli può avvenire attraverso due vie, a seconda della disponibilità di ossigeno. In condizioni aerobiche, il NADH viene ossidato principalmente attraverso la respirazione per generare ATP, mentre in condizioni anaerobiche, può essere ossidato attraverso percorsi di fermentazione per produrre lattato ed etanolo. Ceppi mutanti di E. coli, incapaci di utilizzare percorsi di fermentazione misti per l'ossidazione del NADH durante la crescita anaerobica, sono stati utilizzati per guidare le vie ossidanti del NADH per la sintesi anaerobica di varie sostanze chimiche, come 2-metilpropan-1-olo, 2,3-butandiolo, 1-butanolo e L-alanina. Questi ceppi mutanti sono stati anche usati per ingegnerizzare enzimi sfruttando principi redox simili, con conseguente miglioramento delle varianti. I ceppi risultanti possono essere utilizzati per progettare altri enzimi e percorsi dipendenti da NAD (P) H.

Mutanti carenti nella riduzione del NAD+

Wenk et al. hanno creato un ceppo di E. coli eliminando il gene della diidrolipoil deidrogenasi (lpd), che ha portato il ceppo a non essere in grado di generare energia riducente (NADH e NADPH) dal metabolismo dell'acetato a causa dell'assenza di attività della piruvato deidrogenasi. Ciò ha fatto sì che il ceppo mostrasse auxotrofia per ridurre la potenza quando coltivato aerobicamente su acetato come unica fonte di carbonio. (mostrato come figura 2) Il ceppo è stato in grado di crescere sull'acetato quando integrato con substrati glicolitici superiori o quando esprime formiato NAD+-dipendente, etanolo o metanolo deidrogenasi con i rispettivi substrati. Il ceppo non è stato utilizzato per l'ingegneria enzimatica ed è stato valutato solo per l'auxotrofia dei cofattori redox.
 

Figura 2: Metabolismo centrale

Mutanti carenti di ossidazione del NADPH

Esistono due diverse strategie per indurre l'auxotrofia NADP + in E. coli, basandosi sull'ingegneria della via glicolitica per sovrapprodurre NADPH. La prima strategia prevede l'eliminazione del gene gapA nativo e l'espressione di un enzima GAPDH eterologo NADP + dipendente, mentre la seconda strategia prevede il reindirizzamento del flusso di carbonio attraverso la via del pentoso fosfato. I ceppi risultanti non sono in grado di crescere sul glucosio ma mostrano una crescita in condizioni diverse, con il primo ceppo coltivato in condizioni anaerobiche e il secondo in condizioni aerobiche con glicerolo come substrato. Questi ceppi sono utilizzati per ingegnerizzare enzimi con proprietà migliorate, tra cui la specificità del substrato, l'attività catalitica e la termostabilità.

Mutanti carenti di riduzione del NADP+

Tre diversi batteri, E. coli, P. putida, e C. glutamicum, sono stati progettati per essere NADPH-auxotrofico, il che significa che richiedono NADPH esogeno per la crescita. Nel caso di E. coli e C. glutamicum, gli enzimi metabolici centrali sono stati eliminati per evitare la riduzione di NADP + quando il glucosio è stato fornito come fonte di carbonio, mentre in P. putida, l'ingegneria assistita da CRISPR / nCas9 è stata utilizzata per interrompere sequenzialmente set di geni bersaglio per comprendere il loro coinvolgimento nel metabolismo redox. I ceppi NADPH-auxotrofi sono stati quindi utilizzati per l'ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita basata sulla specificità dei cofattori. Un singolo ciclo di mutagenesi con E. coli ha prodotto la formiato deidrogenasi NADP+-dipendente più efficiente e specifica fino ad oggi, mentre P. putida e C. glutamicum rappresentano i primi ceppi della loro specie che possono essere utilizzati per questo tipo di ingegneria.

Mutanti carenti di riduzione NMN+

È stato sviluppato un sistema di selezione accoppiato alla crescita per collegare il ciclo dei cofattori e la crescita sulla base di una carenza nella riduzione di NMN +. È stato utilizzato il ceppo E. coli SHuffle, che porta delezioni in due geni coinvolti nella produzione di glutatione ridotto. Una glutatione reduttasi NMNH-dipendente è stata sviluppata attraverso la mutagenesi razionale per collegare il processo al ciclo NMN+/NMNH, e una glucosio deidrogenasi NMN+-dipendente è stata utilizzata per supportare il ciclo del cofattore NMN+/NMNH e quindi la crescita. Lo studio ha anche applicato per la prima volta l'auxotrofia dei cofattori redox non canonici per l'ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita, risultando in una variante termostabile della fosfito deidrogenasi con una migliore efficienza catalitica e stabilità temporale in vitro. Il lavoro fornisce un ceppo utile per l'ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita, dipendente dal ciclo NMN+/NMNH e auxotrofico per lo stato ridotto di un cofattore redox non canonico.

 

Il potenziale dell'accoppiamento crescita-crescita tramite cofattori redox ha funzionato come un potente strumento per progettare biocatalizzatori, in particolare nel contesto della bioproduzione sostenibile. Sebbene siano stati compiuti notevoli progressi nella generazione di ceppi auxotrofici di cofattori redox, la dichiarazione suggerisce che ci sono ancora diverse strade inesplorate per la ricerca. Uno di questi riguarda l'ingegneria di ceppi auxotrofici di cofattori di organismi diversi da E. coli, che potrebbero aprire nuove possibilità per l'ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita.

Nel complesso, suggerisce che l'uso dell'accoppiamento crescita-cofattore basato su cofattori redox rappresenta una grande opportunità per la biocatalisi ingegneristica, in particolare per la produzione di prodotti che non possono soddisfare i requisiti di altri approcci di ingegneria enzimatica ad alto rendimento. Sottolinea la necessità di sviluppare biocatalizzatori più versatili ed efficienti per la bioproduzione sostenibile e sottolinea l'importanza di continuare la ricerca in questo settore.


Riferimento: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita attraverso la manipolazione della rigenerazione dei cofattori redox, Biotechnology Advances, 2023.