L'ottimizzazione delle condizioni di reazione per ottenere un'elevata resa di Stevia Rebaudioside D
Le diete ad alto contenuto di zucchero hanno portato a una crescente prevalenza di varie malattie croniche, tra cui obesità, diabete, malattie cardiovascolari e ipertensione, ponendo una significativa preoccupazione per la salute pubblica globale. Stevia Rebaudioside D (Reb D), un dolcificante naturale derivato dalle piante, ha guadagnato un'attenzione significativa come sostituto dello zucchero grazie al suo contenuto calorico zero, alla dolcezza intensa e al profilo gustativo piacevole.
Tuttavia, la sua presenza limitata nella stevia rebaudiana Bertoni e le sfide legate alla bassa solubilità e all'attività enzimatica della glicosiltransferasi di origine vegetale hanno ostacolato la sua diffusa applicazione commerciale. In risposta a questi problemi, è stata scoperta una nuova glicosiltransferasi chiamata YojK, proveniente dal Bacillus subtilis 168. Questo studio introduce una glicosiltransferasi batterica geneticamente modificata, YojK-I241T/G327N, caratterizzata da elevata solubilità ed efficienza catalitica, offrendo un grande potenziale per la produzione su scala industriale di Reb D.
Lo sviluppo di un metodo altamente efficiente per la produzione di rebaudioside D utilizzando una reazione a cascata degli enzimi YojK-I241T/G327N e AtSuSy.
Per affrontare il problema della bassa solubilità nelle glicosiltransferasi di origine vegetale, i ricercatori hanno studiato il potenziale dell'uso di YojK, una O-glicosiltransferasi da Bacillus subtilis 168. YojK è stato scelto per la sua attività di glicosilazione dimostrata con vari substrati, comprese le grandi molecole. Dopo aver avuto successo nell'espressione e nella purificazione ricombinante, YojK è stato impiegato per glicosilare Reb A, con conseguente produzione di Stevia Reb D. L'analisi cinetica enzimatica ha rivelato che YojK ha un'attività catalitica inferiore verso Reb D rispetto ad altre glicosiltransferasi. Di conseguenza, lo studio suggerisce la necessità di un'ingegneria guidata dalla struttura per migliorare l'attività catalitica di YojK per potenziali applicazioni pratiche. (come mostrato nella Figura 1)
Figura 1
L'ottimizzazione delle condizioni di reazione per ottenere un'elevata resa di rebaudioside D.
Le condizioni di reazione, tra cui pH, temperatura e concentrazione del substrato, possono essere ottimizzate per ottenere un'elevata resa di Srevia Reb D. Lo studio ha utilizzato simulazioni di dinamica molecolare per studiare come la variante YojK-I241T / G327N migliora la glicosilazione di Reb D. La variante ha mantenuto un legame idrogeno stabile tra Reb A e H14 durante le simulazioni, a differenza del wild-type (come mostrato in Figura 2). Questa stabilità si estendeva anche alla distanza tra l'atomo di O2 di Reb A e il C1P di UDPG. La migliore efficienza catalitica della variante YojK-I241T/G327N è stata attribuita a queste interazioni stabili, suggerendo il suo potenziale pratico.
Figura 2
Figura 3
Conclusione
Questo approccio ha prodotto l'83,47% di Reb D. In particolare, l'aggiunta di 1 mM UDPG ha permesso la sintesi di 20,59 g / L Reb D con una notevole resa del 91,29%, superando gli studi precedenti. Questo processo dimostra il potenziale per la produzione Reb D su scala industriale, specialmente dopo l'ingegneria strutturale di YojK.YojK può essere efficacemente espresso in E. coli BL21 (DE3) con elevata solubilità. Attraverso l'ingegneria guidata dalla struttura, è stato creato un doppio mutante, YojK-I241T / G327N, che consente la produzione su larga scala di Reb D con una resa eccezionale del 91,29% riciclando UDPG catalizzato dalla saccarosio sintasi AtSuSy. Questo studio presenta YojK-I241T/G327N come uno strumento promettente per la produzione di Reb D su scala industriale economicamente efficace.
