Ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita attraverso la manipolazione della rigenerazione dei cofattori redox

Una gamma sempre più ampia di sostanze chimiche viene ora prodotta da materie prime rinnovabili tramite mezzi biotecnologici. I bioprocessi dipendono fortemente dalla catalisi enzimatica per la produzione efficiente di questi composti. Garantire che gli enzimi funzionino al meglio nell'ambiente richiesto è quindi di grande interesse per la produzione sostenibile.

Proprietà come la specificità del substrato, la velocità catalitica e la (termo)stabilità sono tra i diversi fattori critici che devono essere ottimizzati per bioprocessi efficienti guidati dagli enzimi. Questa ottimizzazione può richiedere tempo, costosa e impegnativa, e quindi modi efficaci ed efficienti in termini di costi per la selezione accoppiata alla crescita, gli enzimi ingegneristici con caratteristiche desiderabili sono molto ricercati.

I vantaggi dell'uso della selezione accoppiata alla crescita come forma di selezione enzimatica, che consiste nel collegare l'attività di un enzima alla crescita di una cellula. Questo metodo può essere utilizzato come strategia di selezione ad alto throughput e può essere ottenuto assicurando che la crescita dipenda dalla sintesi del prodotto da parte dell'enzima bersaglio o collegando l'attività dell'enzima allo stato energetico globale della cellula. La biologia sintetica può essere utilizzata per ingegnerizzare ceppi adatti alla selezione accoppiata in crescita, e i progressi recenti si sono concentrati sull'ingegneria di ceppi carenti negli stati ossidati o ridotti delle coppie di cofattori redox, che possono fungere da piattaforme per l'ingegneria enzimatica. L'uso di queste piattaforme potrebbe accelerare lo sviluppo di biocatalizzatori e bioprocessi migliorati.

Benefici dell'accoppiamento della crescita tramite auxotrofia di cofattori

I vantaggi dell'uso dell'auxotrofia dei cofattori come metodo di selezione per enzimi ingegneristici coinvolti nella biosintesi di determinate sostanze chimiche, come lipidi, biocarburanti, gas, solventi organici o composti polimerici. Questo approccio offre diversi benefici unici, tra cui la possibilità di selezionare il prodotto desiderato indipendentemente dal substrato o dal prodotto di interesse, facilitando la rilevazione di un miglioramento dell'attività enzimatica e offrendo una lettura per rilevare l'attività enzimatica migliorata. Inoltre, l'uso di auxofattori come piattaforme di accoppiamento della crescita è vantaggioso perché la natura ubiquitaria dei cofattori redox nel metabolismo microbico significa che le strategie ingegneristiche possono essere trasferite lateralmente ad altri microrganismi di interesse e gli enzimi possono essere direttamente ingegnerizzati nell'ambiente dell'ospite microbico desiderato. (mostrato come figura 1)

Figura 1: Confronto di diverse tecniche di screening/selezione ampiamente utilizzate per l'ingegneria enzimatica

Mutanti carenti di ossidazione NADH

L'ossidazione del NADH in E. coli può avvenire attraverso due vie, a seconda della disponibilità di ossigeno. In condizioni aerobiche, il NADH viene principalmente ossidato tramite la respirazione per generare ATP, mentre in condizioni anaerobiche può essere ossidato tramite vie di fermentazione per produrre lattato ed etanolo. I ceppi mutanti di E. coli, incapaci di utilizzare vie di fermentazione miste per l'ossidazione del NADH durante la crescita anaerobica, sono stati impiegati per guidare vie ossidanti del NADH per la sintesi anaerobica di varie sostanze chimiche, come 2-metilpropano-1-olo, 2,3-butanediolo, 1-butanolo e L-alanina. Questi ceppi mutanti sono stati anche utilizzati per ingegnerizzare enzimi sfruttando principi redox simili, con conseguente miglioramento di varianti. I ceppi risultanti possono essere utilizzati per ingegnerizzare altri enzimi e vie dipendenti da NAD(P)H.

Mutanti carenti di riduzione NAD+  

Wenk et al. hanno creato un ceppo di E. coli eliminando il gene diidrolipoil deidrogenasi (lpd), il che ha fatto sì che il ceppo non potesse generare potenza riducente (NADH e NADPH) dal metabolismo dell'acetato a causa dell'assenza di attività di piruvato deidrogenasi. Questo faceva sì che la deformazione mostrasse auxotrofia per ridurre la potenza quando cresciuta aerobicamente su acetato come unica fonte di carbonio. (mostrato come figura 2) Il ceppo è stato in grado di crescere su acetato quando integrato con substrati glicolitici superiori o quando esprimeva deidrogenasi formati, etanolo o metanolo dipendenti da NAD+ con i rispettivi substrati. Il ceppo non è stato utilizzato per l'ingegneria enzimatica ed è stato valutato solo per l'auxotrofia del cofattore redox.
 

Figura 2: Metabolismo centrale 

Mutanti carenti nell'ossidazione da NADPH

Esistono due strategie diverse per indurre l'auxotrophy di NADP+ in E. coli, basandosi sull'ingegneria della via glicolitica per sovraprodurre NADPH. La prima strategia consiste nell'eliminazione del gene gapA nativo ed esprimendo un enzima GAPDH eterologo dipendente da NADP+, mentre la seconda strategia consiste nel reindirizzare il flusso di carbonio attraverso la via del pentosio fosfato. I ceppi risultanti non riescono a crescere sul glucosio ma mostrano crescita in condizioni diverse, con il primo ceppo coltivato in condizioni anaerobiche e il secondo in condizioni aerobiche con il glicerolo come substrato. Questi ceppi sono utilizzati per ingegnerizzare enzimi con proprietà migliorate, tra cui specificità del substrato, attività catalitica e termostabilità.

Mutanti carenti di riduzione NADP+

Tre batteri diversi, E. coli, P. putida e C. glutamicum, sono stati ingegnerizzati per essere NADPH-auxotrofi, il che significa che necessitano di NADPH esogeno per la crescita. Nel caso di E. coli e C. glutamicum, gli enzimi metabolici centrali sono stati eliminati per evitare la riduzione del NADP+ quando il glucosio è stato fornito come fonte di carbonio, mentre in P. putida, l'ingegneria assistita da CRISPR/nCas9 è stata utilizzata per interrompere sequenzialmente insiemi di geni bersaglio e comprenderne il coinvolgimento nel metabolismo redox. I ceppi NADPH-auxotrofi sono stati poi utilizzati per l'ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita basata sulla specificità dei cofattori. Un singolo ciclo di mutagenesi con E. coli ha prodotto la deidrogenasi formatata NADP+ dipendente più efficiente e specifica fino ad oggi, mentre P. putida e C. glutamicum rappresentano i primi ceppi della loro specie che possono essere utilizzati per questo tipo di ingegneria.

Mutanti carenti nella riduzione NMN+

È stato sviluppato un sistema di selezione accoppiato alla crescita per collegare il ciclo dei cofattori e la crescita basato su una carenza nella riduzione di NMN+. È stato utilizzato il ceppo SHuffle di E. coli, che porta con sé le delezioni in due geni coinvolti nella produzione di glutatione ridotto. Una glutatione reduttasi dipendente da NMNH è stata sviluppata tramite mutagenesi razionale per collegare il processo al ciclo NMN+/NMNH, e una deidrogenasi glucosio dipendente da NMN+ è stata utilizzata per supportare il ciclo dei cofattori NMN+/NMNH e quindi la crescita. Lo studio ha inoltre applicato per la prima volta l'auxotrofia dei cofattori redox non canonici per l'ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita, ottenendo una variante termostabile della fosfite deidrogenasi con maggiore efficienza catalitica e stabilità temporale in vitro. Il lavoro fornisce una deformazione utile per l'ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita, dipendente dal ciclo NMN+/NMNH e auxotrofica per lo stato ridotto di un cofattore redox non canonico.

Il potenziale del coppiamento della crescita tramite cofattori redox ha funzionato come uno strumento potente per ingegnerizzare i biocatalizzatori, in particolare nel contesto della bioproduzione sostenibile. Sebbene siano stati fatti notevoli progressi nella generazione di ceppi auxotrofici con cofattori redox, la dichiarazione suggerisce che esistono ancora diverse strade di ricerca inesplorate. Uno di questi riguarda l'ingegneria di ceppi auxotrofi di organismi diversi da E. coli, il che potrebbe aprire nuove possibilità per l'ingegneria degli enzimi accoppiati alla crescita.

Nel complesso, suggerisce che l'uso del coupling di crescita basato su cofattori redox rappresenta una grande opportunità per l'ingegneria della biocatalisi, in particolare per la produzione di prodotti che non soddisfano i requisiti di altri approcci di ingegneria enzimatica ad alta produttività. Sottolinea la necessità di sviluppare biocatalizzatori più versatili ed efficienti per una bioproduzione sostenibile e sottolinea l'importanza di continuare la ricerca in questo ambito.


Riferimento: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Ingegneria enzimatica accoppiata alla crescita attraverso la manipolazione della rigenerazione dei cofattori redox, Biotechnology Advances, 2023.