L'ottimizzazione delle condizioni di reazione per ottenere un alto rendimento di Stevia Rebaudioside D
Le diete ad alto contenuto di zuccheri hanno portato a un aumento della prevalenza di varie malattie croniche, tra cui obesità, diabete, malattie cardiovascolari e ipertensione, rappresentando una significativa preoccupazione globale per la salute pubblica. Stevia Rebaudioside D (Reb D), un dolcificante naturale derivato dalle piante, ha attirato notevole attenzione come sostituto dello zucchero grazie al suo contenuto calorico, alla dolcezza intensa e al gusto gradevole.
Tuttavia, la sua presenza limitata nella stevia rebaudiana Bertoni e le difficoltà legate alla bassa solubilità e attività enzimatica della glicosiltransferasi di origine vegetale hanno ostacolato la sua ampia applicazione commerciale. In risposta a questi problemi, fu scoperta una nuova glicosiltransferasi chiamata YojK, originata da Bacillus subtilis 168. Questo studio introduce una glicosiltransferasi batterica geneticamente modificata, YojK-I241T/G327N, caratterizzata da alta solubilità ed efficienza catalitica, offrendo un grande potenziale per la produzione su scala industriale di Reb D.
Lo sviluppo di un metodo altamente efficiente per la produzione di rebaudioside D utilizzando una reazione a cascata di enzimi YojK-I241T/G327N e AtSuSy.
Per affrontare la bassa solubilità nelle glicosiltransferasi di origine vegetale, i ricercatori hanno indagato il potenziale dell'uso di YojK, una glicosiltransferasi O-glicosiltransferasi di Bacillus subtilis 168. YojK è stato scelto per la sua dimostrata attività di glicosilazione con vari substrati, incluse molecole di grandi dimensioni. Dopo una riuscita espressione e purificazione ricombinante, YojK è stato impiegato per glicosilare Reb A, portando alla produzione di Stevia Reb D. L'analisi cinetica enzimatica ha rivelato che YojK ha un'attività catalitica inferiore verso Reb D rispetto ad altre glicosiltransferasi. Di conseguenza, lo studio suggerisce la necessità di un'ingegneria guidata dalla struttura per potenziare l'attività catalitica di YojK a favore di potenziali applicazioni pratiche. (come mostrato nella Figura 1)
Figura 1
L'ottimizzazione delle condizioni di reazione per ottenere un alto rendimento di rebaudioside D.
Le condizioni di reazione, inclusi pH, temperatura e concentrazione nel substrato, possono essere ottimizzate per ottenere un alto rendimento di Srevia Reb D. Lo studio ha utilizzato simulazioni di dinamica molecolare per indagare come la variante YojK-I241T/G327N migliori la glicosilazione Reb D. La variante manteneva un legame a idrogeno stabile tra Reb A e H14 durante le simulazioni, a differenza del tipo selvatico (come mostrato nella Figura 2). Questa stabilità si estendeva anche alla distanza tra l'atomo di O2 di Reb A e il C1P di UDPG. La migliorata efficienza catalitica della variante YojK-I241T/G327N è stata attribuita a queste interazioni stabili, suggerendone il potenziale pratico.
Figura 2
Figura 3
Conclusione
Questo approccio ha prodotto l'83,47% di Reb D. In particolare, aggiungere 1 mM di UDPG ha permesso la sintesi di 20,59 g/L di Reb D con un notevole 91,29% di resa superiore. Questo processo dimostra il potenziale per la produzione su scala industriale di Reb D, specialmente dopo l'ingegneria strutturale di YojK.YojK può essere espresso efficacemente in E. coli BL21 (DE3) con alta solubilità. Attraverso l'ingegneria guidata dalla struttura, è stato creato un doppio mutante, YojK-I241T/G327N, che ha permesso la produzione su larga scala di Reb D con una resa eccezionale del 91,29% tramite il riciclo di UDPG catalizzato dalla saccarosi sintasi AtSuSy. Questo studio presenta YojK-I241T/G327N come uno strumento promettente per una produzione industriale di Reb D su scala economicamente efficace.
