L'ottimizzazione delle condizioni di reazione per ottenere un'alta resa di Stevia Rebaudioside D
Le diete ad alto contenuto di zucchero hanno portato a una crescente prevalenza di varie malattie croniche, tra cui obesità, diabete, malattie cardiovascolari e ipertensione, rappresentando una significativa preoccupazione per la salute pubblica globale. La Stevia Rebaudioside D (Reb D), un dolcificante naturale derivato dalle piante, ha attirato notevole attenzione come sostituto dello zucchero grazie al suo contenuto zero calorie, all'intensa dolcezza e al profilo gustativo gradevole.
Tuttavia, la sua presenza limitata nella Stevia rebaudiana Bertoni e le sfide legate alla bassa solubilità e all'attività enzimatica della glicosiltransferasi di origine vegetale hanno ostacolato la sua ampia applicazione commerciale. In risposta a questi problemi, è stato scoperto un nuovo glicosiltransferasi chiamato YojK, originario di Bacillus subtilis 168. Questo studio introduce una glicosiltransferasi batterica geneticamente modificata, YojK-I241T/G327N, caratterizzata da elevata solubilità ed efficienza catalitica, offrendo un grande potenziale per la produzione su scala industriale di Reb D.
Lo sviluppo di un metodo altamente efficiente per la produzione di rebaudioside D utilizzando una reazione a cascata degli enzimi YojK-I241T/G327N e AtSuSy.
Per affrontare il problema della bassa solubilità nelle glicosiltransferasi di origine vegetale, i ricercatori hanno studiato il potenziale dell'uso di YojK, una O-glicosiltransferasi di Bacillus subtilis 168. YojK è stato scelto per la sua dimostrata attività di glicosilazione con vari substrati, incluse grandi molecole. Dopo la riuscita espressione ricombinante e purificazione, YojK è stato impiegato per glicosilare Reb A, portando alla produzione di Stevia Reb D. L'analisi cinetica enzimatica ha rivelato che YojK ha una minore attività catalitica verso Reb D rispetto ad altre glicosiltransferasi. Di conseguenza, lo studio suggerisce la necessità di un'ingegneria guidata dalla struttura per migliorare l'attività catalitica di YojK per potenziali applicazioni pratiche. (come mostrato nella Figura 1)
Figura 1
L'ottimizzazione delle condizioni di reazione per ottenere un'alta resa di rebaudioside D.
Le condizioni di reazione, inclusi pH, temperatura e concentrazione del substrato, possono essere ottimizzate per ottenere un'alta resa di Stevia Reb D. Lo studio ha utilizzato simulazioni di dinamica molecolare per indagare come la variante YojK-I241T/G327N migliora la glicosilazione di Reb D. La variante ha mantenuto un legame idrogeno stabile tra Reb A e H14 durante le simulazioni, a differenza del tipo selvatico (come mostrato nella Figura 2). Questa stabilità si è estesa anche alla distanza tra l'atomo O2 di Reb A e il C1P di UDPG. L'efficienza catalitica migliorata della variante YojK-I241T/G327N è stata attribuita a queste interazioni stabili, suggerendo il suo potenziale pratico.
Figura 2
Figura 3
Conclusione
Questo approccio ha prodotto l'83,47% di Reb D. In particolare, l'aggiunta di 1 mM di UDPG ha consentito la sintesi di 20,59 g/L di Reb D con una notevole resa del 91,29%, superando studi precedenti. Questo processo dimostra il potenziale per la produzione su scala industriale di Reb D, specialmente dopo l'ingegneria strutturale di YojK.YojK può essere espresso efficientemente in E. coli BL21 (DE3) con elevata solubilità. Attraverso l'ingegneria guidata dalla struttura, è stato creato un doppio mutante, YojK-I241T/G327N, che consente la produzione su larga scala di Reb D con una resa eccezionale del 91,29% riciclando UDPG catalizzato dalla saccarosio sintasi AtSuSy. Questo studio presenta YojK-I241T/G327N come uno strumento promettente per una produzione su scala industriale di Reb D economicamente efficace.
