Quantificazione del NAD+ e i suoi metaboliti nei nervi sciatici del topo
Introduzione
Le parti cruciali della nicotinamide, adenina dinucleotide (NAD+) e dei suoi metaboliti nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione sono state ampiamente riconosciute. Per stimolare i progressi verso la ricerca biochimica e interventi rivolti all'invecchiamento e alle malattie neurodegenerative, è di grande importanza quantificare accuratamente il NAD+ e i suoi livelli di metaboliti nel percorso di recupero del NAD+. Qui, viene applicato un metodo LC-MS/MS robusto e accurato per quantificare NAD+ e i suoi livelli di metaboliti nel nervo sciatico normale e lesionato del topo.Limitazioni dei metodi esistenti per quantificare NAD+ e i suoi metaboliti
I metodi tradizionali per quantificare NAD+ e i suoi metaboliti, come HPLC-UV, NMR, elettroforesi a zona capillare o saggi enzimatici colorimetrici, affrontano varie sfide in termini di sensibilità, selettività e misurazione indiretta. Per quanto riguarda i test LC-MS/MS esistenti per le misurazioni di NAD+ cellulare o tissutale e dei suoi metaboliti, ci sono ancora molte difficoltà da superare, come tempi di esecuzione prolungati, scarso comportamento di ritenzione cromatografica e forme di picco insoddisfacenti. Inoltre, solo da una a tre sostanze nella via di recupero NAD+ possono essere coperte da questi metodi.Le modifiche del metodo LC-MS/MS
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Inoltre, le condizioni di MS sono ottimizzate per minimizzare il segnale di interferenza NAD+ nel canale ciclico di adenosina difosfato ribosio (cADPR) mantenendo la risposta di cADPR e mononucleotide di nicotinamide (NMN), con 4000V per la tensione di irrazione ionica, 450°C per la temperatura del turboriscaldatore, 50 psi per il Gas 1, 50 psi per il Gas 2, 30 psi per il gas a tenda e 12 psi per il gas di collisione.
Cromaografia rappresentativa di campioni di nervi (normali vs lesionati)
Tutti e cinque gli analiti raggiungono la separazione di base, dove cADPR è un biomarcatore sensibile nel modello di neurodegenerazione. In questo caso, l'assonotomia del nervo sciatico induce degenerazione assonale, portando a una riduzione del livello di NAD+ e a un aumento elevato di NMN nei nervi lesionati, con conseguente aumento di circa 2 volte del rapporto NMN/NAD+. Contemporaneamente, i livelli di nicotinamide (NAM) e adenosina difosfato ribosio (ADPR) sono diminuiti di circa 2 volte, mentre il livello di cADPR è aumentato di oltre 8 volte. Questi risultati sono coerenti con quelli delle ricerche precedentemente riportate, verificando l'accuratezza di questo metodo modificato LS-MS/MS nella quantificazione del NAD+ e dei suoi metaboliti.
Conclusionee
Questo metodo modificato LC-MS/MS consente una separazione efficace di base di NAD+, NMN, NAM, ADPR e cADPR in un breve tempo di esecuzione di 5 minuti, contribuendo alla diagnosi precoce di vari disturbi neurologici e allo sviluppo di farmaci per malattie dell'invecchiamento e neurodegenerative.Riferimento
Ma Y, Deng L, Du Z. Sviluppo e validazione di un metodo LC-MS/MS per quantificare NAD+ e metaboliti correlati nei nervi sciatici di topi e la sua applicazione a un modello animale per lesioni nervose. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC dal 2012 si dedica alla R&S, alla produzione e vendita di materie prime per coenzimi e prodotti naturali, con fabbriche autonome, oltre 170 brevetti globali e un forte team di R&S. BONTAC vanta una ricca esperienza in R&D e tecnologia avanzata nella biosintesi di NAD e i suoi predecessori (ad esempio, NMN e NR). Ci sono vari tipi di NAD da selezionare, tra cui NAD ER Grade (rimozione dell'endossina), NAD Grado I (IVD/integratori alimentari/polvere cruda cosmetica), NAD Grado II (API/intermedi) e NAD Grado IV (se richiedono maggiore solubilità), che possono essere forniti sotto forma di polvere liofilizzata o cristallina. La purezza del NAD BONTAC può superare il 98%.
