Quantificazione di NAD+ e dei suoi Metaboliti nei Nervi Sciatici del Topo
Introduzione
Le parti cruciali del nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+) e dei suoi metaboliti nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione sono state ampiamente riconosciute. Per stimolare il progresso verso la ricerca biochimica e gli interventi mirati all'invecchiamento e alle malattie neurodegenerative, è di grande importanza quantificare con precisione i livelli di NAD+ e dei suoi metaboliti nella via di recupero del NAD+. Qui, un metodo LC-MS/MS robusto e accurato viene applicato per quantificare i livelli di NAD+ e dei suoi metaboliti nel nervo sciatico di topo normale e lesionato.Limitazioni dei metodi esistenti per la quantificazione di NAD+ e dei suoi metaboliti
I metodi tradizionali per quantificare NAD+ e i suoi metaboliti, come HPLC-UV, NMR, elettroforesi capillare a zona, o saggi enzimatici colorimetrici, affrontano varie sfide in termini di sensibilità, selettività e misurazione indiretta. Per quanto riguarda i saggi LC-MS/MS esistenti per la misurazione di NAD+ e dei suoi metaboliti cellulari o tissutali, ci sono ancora molte difficoltà da superare, come tempi di esecuzione prolungati, scarso comportamento di ritenzione cromatografica e forme di picco insoddisfacenti. Inoltre, solo una o tre sostanze nella via di recupero del NAD+ possono essere coperte da questi metodi.Le modifiche del metodo LC-MS/MS
Sulla base dei saggi LC-MS/MS esistenti, vengono condotte modifiche riguardanti le condizioni cromatografiche, la matrice surrogata e le condizioni MS/MS. Nello specifico, 5 μM di acido metilenfosfonico viene impiegato come additivo della fase mobile, che promuove esplicitamente l'intensità del segnale e la forma del picco. Data la natura relativamente pulita e semplice dei campioni e le loro piccole dimensioni, l'acqua ultrapura viene testata come matrice sostitutiva. Invece della colonna a cromatografia liquida a interazione idrofila e della colonna hypercarb, viene utilizzata la colonna Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, la cui tecnologia unica MaxPeak HPS ad alte prestazioni di superficie (passivazione della parete interna della colonna, eliminazione della superficie metallica) consente un'elevata riproducibilità, simmetria del picco e separazione di base di tutti gli analiti.Inoltre, le condizioni MS vengono ottimizzate per minimizzare il segnale di interferenza di NAD+ nel canale del ribosio adenosina difosfato ciclico (cADPR) mantenendo la risposta di cADPR e nicotinamide mononucleotide (NMN), con 4000V per la tensione dello spray ionico, 450℃ per la temperatura del turbo heater, 50 psi per Gas 1, 50 psi per Gas 2, 30 psi per il gas di cortina e 12 psi per il gas di collisione.
Cromatogramma rappresentativo dei campioni di nervo (normale vs lesionato)
Tutti e cinque gli analiti raggiungono la separazione di base, dove cADPR è un biomarcatore sensibile nel modello di neurodegenerazione. Qui, l'assotomia del nervo sciatico induce degenerazione assonale, portando a una riduzione del livello di NAD+ e a un elevato livello di NMN nei nervi lesionati, con un aumento di circa 2 volte del rapporto NMN/NAD+. Contemporaneamente, i livelli di nicotinamide (NAM) e adenosina difosfato ribosio (ADPR) diminuiscono di circa 2 volte, mentre il livello di cADPR aumenta di oltre 8 volte. Questi risultati sono coerenti con quelli di studi precedentemente riportati, verificando l'accuratezza di questo metodo LC-MS/MS modificato nella quantificazione di NAD+ e dei suoi metaboliti.
Conclusione
Questo metodo LC-MS/MS modificato consente un'efficace separazione di base di NAD+, NMN, NAM, ADPR e cADPR in un breve tempo di esecuzione di 5 minuti, che è utile per la diagnosi precoce di vari disturbi neurologici e per lo sviluppo di farmaci per l'invecchiamento e le malattie neurodegenerative.Riferimenti
Ma Y, Deng L, Du Z. Sviluppo e validazione di un metodo LC-MS/MS per quantificare NAD+ e metaboliti correlati nei nervi sciatici di topo e la sua applicazione a un modello animale di lesione nervosa. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACè dedicato alla ricerca e sviluppo, produzione e vendita di materie prime per coenzimi e prodotti naturali dal 2012, con fabbriche di proprietà, oltre 170 brevetti globali e un forte team di ricerca e sviluppo. BONTAC ha una ricca esperienza di ricerca e sviluppo e tecnologia avanzata nella biosintesi diNAD e suoi precursori(es. NMN e NR). Esistono vari tipi di NAD tra cui scegliere, che comprendono NAD ER Grade (rimozione delle endotossine), NAD Grade I (polvere grezza per IVD/integratore alimentare/cosmetici), NAD Grade II (API/intermedi) e NAD Grade IV (se vi sono requisiti più elevati sulla solubilità), che possono essere forniti sotto forma di polvere liofilizzata o polvere cristallina. La purezza del NAD BONTAC può raggiungere oltre il 98%.
